Częstość występowania i spektrum mutacji germinalnych genu p53 wśród pacjentów z mięsakiem cd

Spośród pozostałych ośmiorga pacjentów, u trzech pacjentów stwierdzono raka w rodzinie spełniające kryteria zespołu Li-Fraumeni (to znaczy, że przed osiągnięciem wieku 45 lat probanda otrzymał diagnozę mięsaka i miał krewnego pierwszego stopnia z rakiem grupa wiekowa i inny krewny pierwszego lub drugiego stopnia z rakiem przed 45 rokiem życia lub mięsakiem w każdym wieku) 5 i 5 pacjentów miało rodzinną historię raka, której nie można definitywnie zaklasyfikować do zespołu Li-Fraumeni (trzech pacjentów miało tylko jednego znanego krewnego z rakiem, jeden pacjent miał babcię z rakiem piersi i siostrzenicę z szyszynką, a jeden pacjent miał co najmniej jednego krewnego z osteosarcoma, ale dokładna liczba dotkniętych była nieznana). Grupę kontrolną stanowiło 100 niepowiązanych małżonków pacjentów z chorobą dziedziczną (niezłośliwą), z mieszanym pochodzeniem północnoamerykańskim, którego historia osobnicza lub rodzinna była nieznana; 75 niespokrewnionych dorosłych pochodzenia japońskiego, których wywiad rodzinny lub rodzinny był nieznany; oraz 25 japońskich pacjentów z łagodnymi nowotworami kości lub tkanek miękkich. Screening for Mutations
Wstępne badania przesiewowe pod kątem mutacji przeprowadzono przez powielenie PCR z genomowego DNA, a następnie analizę SSCP zamplifikowanych fragmentów. 25, 26 To podejście okazało się szybką i czułą metodą wykrywania zmian sekwencji DNA tak małych jak pojedyncza baza. substytucja.25 Próbki DNA wykazujące wariant pasma za pomocą analizy SSCP analizowano przez bezpośrednie sekwencjonowanie genomowe w celu określenia podstawowej zmienności sekwencji.
Analiza SSCP
Analizę SSCP przeprowadzono zgodnie z procedurą Orita i wsp., Z niewielkimi modyfikacjami.26 Oddzielną parę starterów oligonukleotydowych użyto do amplifikacji każdego z egzonów p53 od 2 do 11 z wyjątkiem egzonu 5, w którym analizowano dwa zachodzące na siebie fragmenty PCR. . Każdą sekwencję startera otrzymano z opublikowanych danych lub sekwencjonując genomowe klony ludzkiego genu p53 dostarczone przez dr. L. Crawforda. Fragmenty PCR zawierały co najmniej 10 par zasad (bp) regionów flankujących 5 i 3 każdego eksonu. Aby ograniczyć całkowitą długość fragmentów PCR do mniej niż 200 bp, zwiększając w ten sposób czułość techniki SSCP, w niektórych przypadkach przeprowadzono trawienie enzymem restrykcyjnym. Fragmenty PCR wytworzono z 50 ng genomowego DNA w 50 .l mieszaniny zawierającej 20 umoli trifosforanu deoksyadenozyny, trifosforanu deoksytymidyny lub trójfosforanu deoksyguanozyny na litr; 2 .mol trifosforanu deoksycytydyny na litr; 1,0 do 2,5 mmol chlorku magnezu na litr; 20 pmol każdego startera; 20 mmol buforu TRIS na litr (pH 8,4 lub 8,6); 50 mmol chlorku potasu na litr; 50 .g albuminy surowicy bydlęcej na mililitr; 0,5 jednostki polimerazy Taq (Perkin-Elmer Cetus); i 0,1 ul (7 nmoli na litr) [.-32P] trifosforanu deoksycytydyny (3000 Ci na milimol). Reakcję przeprowadzono przez 30 cykli, składającą się z 30 sekund denaturacji w 94 ° C, 90 sekund wyżarzania w 52 do 60 ° C i 120 sekund w temperaturze 71 ° C z programowalnym kontrolerem termicznym (MJ Research). Jedna dziesiąta surowego zamplifikowanego produktu została zmieszana z 15 do 40 .l mieszaniny 0,1 procent dodecylosiarczanu sodu i 10 mmol EDTA na litr, a następnie rozcieńczenie 1: roztworem do nanoszenia złożonym z 95% formamidu, 89 mmol buforu TRIS na litr, 2 mmol EDTA na litr, 89 mmol kwasu borowego na litr, 0,05 procent błękitu bromofenolowego i 0,05 procent ksylenobutanolu
[więcej w: stomatolog warszawa ursynów, układowe zapalenie naczyń, olx drawsko pomorskie ]