Częstość występowania i spektrum mutacji germinalnych genu p53 wśród pacjentów z mięsakiem czesc 4

Rozcieńczone próbki denaturowano w temperaturze 95 ° C przez dwie minuty, a następnie nanoszono na 6 procentach nieoddrzewających żeli poliakrylamidowych, raz na żelu zawierającym 10 procent glicerolu i drugi raz na żelu, który nie zawierał glicerolu. Elektroforezę prowadzono w temperaturze pokojowej przez 8 do 16 godzin przy stałej mocy 8 W. Autoradiografię wykonywano przez 12 do 24 godzin bez sita wzmacniającego. Bezpośrednie sekwencjonowanie genomowe
Bezpośrednie sekwencjonowanie genomowe dwuniciowych fragmentów PCR przeprowadzono zgodnie z poprzednio opisanymi protokołami27. Pokrótce, amplifikowane próbki DNA oczyszczono przez Sepharose CL-6B (Pharmacia) i połączono z 7 pmol starterów znakowanych końcowo fosforem-32. Mieszaniny starterów i matrycy poddano denaturacji cieplnej i przeprowadzono reakcję sekwencjonowania z enzymem Sequenase (US Biochemical). Produkt analizowano za pomocą elektroforezy na 6 procentach denaturujących żeli poliakrylamidowych. Autoradiografię wykonywano przez 12 do 16 godzin bez ekranu wzmacniającego.
Wyniki
Tabela 1. Tabela 1. Mutacje linii komórkowej genu p53 u ośmiu pacjentów z mięsakiem. Spośród 196 pacjentów z mięsakiem, których badaliśmy, u 8 przeprowadzono mutacje w genie p53 genów p53 (Tabela 1). Zidentyfikowano trzy mutacje w linii płciowej u pacjentów z mięsakiem, u których w momencie rozpoznania nie stwierdzono raka wątroby w rodzinie; pozostałe pięć znaleziono u pacjentów, u których w wywiadzie rodzinnym wystąpił rak. Sześciu z 15 pacjentów, których wybraliśmy do analizy na podstawie ich niezwykłej historii raka (patrz sekcja Metody) mieli mutacje p53 w linii płciowej (3 z 6 miało rodzinną historię raka), podczas gdy tylko 2 z 181 losowo wybranych pacjentów z mięsakiem niesie takie mutacje (oboje mieli rodzinną historię raka). Siedem z ośmiu mutacji linii zarodkowej stwierdzono u pacjentów z rozpoznaniem osteosarcoma, a jeden z nich stwierdzono u pacjenta ze złośliwym włóknistym histiocytomą. W przeciwieństwie do innych badaczy, 3, 4, 23 stwierdziliśmy, że trzy mutacje wystąpiły poza konserwatywnymi domenami genu p53 (kodony od 71 do 72, od 151 do 152 i od 209 do 210). Pozostałe pięć mutacji zidentyfikowano w konserwatywnej domenie (kodony 120, 241, 245, 248 i 282). Rodzaje mutacji, które znaleźliśmy, były również heterogeniczne: cztery powodowało substytucje aminokwasów lub mutacje missense (kodony 241, 245, 248 i 282); reszta spowodowała przedwczesne zakończenie translacji białka lub mutacji nonsensownych, poprzez mutację z przesunięciem ramki o jedną zasadę obejmującą wstawienie (dwa przypadki), delecję dwóch zasad (jeden przypadek) lub bezpośrednie utworzenie kodonu stop (jeden przypadek) ).
Nie wykryto żadnej z ośmiu mutacji w zarodku u pacjentów z mięsakiem u osób kontrolnych.
Pacjenci z nietypową rodzinną historią raka
Rycina 1. Rycina 1. Rodowód i analiza mutacji w genie nowej linii germinalnej genu p53 w rodzinie pacjenta 1. Wiek w momencie diagnozy każdego rodzaju nowotworu pokazano w rodowodzie (panel A). Strzałka wskazuje proband. Panel B przedstawia wyniki analizy SSCP eksonu 7 genu p53 w DNA z obwodowych leukocytów członków rodziny i kontroli. Wariant allelu p53 pojawia się jako dolny prążek w próbkach z probandu (II-3) i jej córki (III-1)
[więcej w: okulista bez skierowania, korony cyrkonowe cena, olx drawsko pomorskie ]