Mutacje genów p53 genu supresorowego p53 u dzieci i młodych dorosłych z wtórnymi nowotworami złośliwymi ad

Jude Children s Research Hospital, 7 z Dana-Farber Cancer Institute, 2 ze szpitala dla chorych dzieci (Toronto), 2 z Massachusetts General Hospital i po z St. Louis Children s Hospital (St. Louis) i Universitäts Krankenhaus- Eppendorf (Hamburg, Niemcy). Każdy pacjent miał dwa pierwotne nowotwory złośliwe; pacjenci byli wykluczeni, jeśli mieli retinoblastomę lub rodzinną historię zespołu Li-Fraumeni. U 27 pacjentów drugi guz powstał w polu radioterapii pierwszego guza, podczas gdy u pozostałych 32 pacjentów albo drugi nowotwór rozwinięty poza polem promieniowania, albo pacjent nie otrzymał wcześniej radioterapii. Szeroka gama leków i protokołów chemioterapeutycznych była stosowana w leczeniu różnych pierwotnych nowotworów. Po uzyskaniu pisemnej zgody uzyskanej zgodnie z protokołami uczestniczących instytucji, od każdego pacjenta pobrano 10 ml krwi do probówek zawierających EDTA. Wszystkie próbki, z wyjątkiem próbek uzyskanych w szpitalu St. Jude, wysyłano do suchego lodu lub w temperaturze 4 ° C do Molecular Genetics Laboratory w Massachusetts General Hospital Cancer Center w celu dalszej analizy. Zbadano 18 próbek zebranych w szpitalu St. Jude w tej instytucji.
DNA ekstrahowano standardowymi metodami z 0,5 ml próbki krwi pełnej od każdego osobnika. Osad DNA ponownie zawieszono w TRIS-EDTA (10 mM TRIS-kwas chlorowodorowy i mM EDTA, pH 7,5) do końcowego stężenia 100 do 500 ng na mikrolitr. Wszystkie 59 próbek amplifikowano w reakcji łańcuchowej polimerazy, a mutacje analizowano za pomocą sekwencjonowania nukleotydów. Dwadzieścia osiem próbek analizowano za pomocą zarówno stałej elektroforezy denaturującej w żelu (CDGE), jak i sekwencjonowania, a pozostałe 31 próbek badano wyłącznie przez sekwencjonowanie, bez elektroforezy. Analiza CDGE wykazała czułość ponad 90% w identyfikacji mutacji p53.22, 23 Aby uzyskać wystarczającą ilość DNA dla tej analizy, która polega na dysocjacji nici fragmentów DNA w domenach topienia zależnych od sekwencji, zamplifikowano matrycę DNA (100 do 300 ng w reakcji 100 .l) w termocyklerze Perkin-Elmer (Cetus) przez 35 cykli, z użyciem protokołu opisanego gdzie indziej.22 Wytworzono cztery zestawy starterów na podstawie teoretycznych profili topnienia amplifikacji. fragmenty.23 Sekwencje te obejmowały cztery zachowane regiony genu p53, które zawierają ponad 80 procent mutacji wcześniej zidentyfikowanych w sporadycznych guzach.22 Fragmenty typu dzikiego i zmutowane zostały odróżnione od siebie w analizie CDGE z użyciem akryloamidu. żele barwione bromkiem etydyny. 22, 24
DNA z próbek krwi amplifikowano za pomocą dwóch starterów, które wytworzyły fragment 1,9 kb zawierający eksony od 5 do 9 genu p53. Fragmenty subklonowano do wektora pBSK (Stratagene) i zsekwencjonowano metodą dideoksynukleotydu Sanger z zestawem Seąuenase 2.0 (US Biochemical). W przypadku próbek badanych w szpitalu St. Jude przeprowadzono analizę sekwencji na pulach co najmniej 100 klonów.25 Dla wszystkich innych próbek, wiele klonów sekwencjonowano indywidualnie, zgodnie z protokołem opisanym gdzie indziej.10 Stosowano wiele starterów do sekwencjonowania odpowiedni region egzonowy na obu niciach
[przypisy: vigrax jak stosować, aspicam bio, olx szydłowiec ]